線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1法)詳細(xì)介紹
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中文名：線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1法)
供應(yīng)商：上海遠(yuǎn)慕
規(guī)格：50T/100T
分類：細(xì)胞檢測(cè)
保存：—20℃,避光,12個(gè)月
保存說(shuō)明： -20℃保存。JC-1(200X)需避光保存，并盡量避免反復(fù)凍融。超純水和JC-1染色緩沖液(5X)也可4℃保存。
用途:細(xì)胞凋亡的生物化學(xué)分析,線粒體膜電位檢測(cè)
組成：主要由JC-1染料儲(chǔ)存液,JC-1 buffer、CCCP等組成,可以檢測(cè)細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位,采用FACS檢測(cè)。
適用范圍：限于科研，實(shí)驗(yàn)，不作臨床
線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1法)詳細(xì)介紹
線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1法)說(shuō)明
1、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1) 是一種以JC-1為熒光探針，快速靈敏地檢測(cè)細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位變化的試劑盒，線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件。
2、通過(guò)JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測(cè)到細(xì)胞膜電位的下降，同時(shí)也可以用JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)檢測(cè)指標(biāo)。
3、JC-1是一種檢測(cè)線粒體膜電位的理想熒光探針。在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)(matrix)中，形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光；
4、在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC-1為單體，產(chǎn)生綠色熒光。這樣就可以非常方便地通過(guò)熒光顏色的轉(zhuǎn)變來(lái)檢測(cè)線粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對(duì)比例來(lái)衡量線粒體去極化的比例。
5、JC-1單體的zui大激發(fā)波長(zhǎng)為514nm，zui大發(fā)射波長(zhǎng)為529nm；JC-1聚合物(J-aggregates)的zui大激發(fā)波長(zhǎng)為585nm，zui大發(fā)射波長(zhǎng)為590nm。實(shí)際觀察時(shí)，使用常規(guī)的觀察紅色熒光和綠色熒光的設(shè)置即可。
6、本試劑盒提供了CCCP作為誘導(dǎo)線粒體膜電位下降的陽(yáng)性對(duì)照。對(duì)于六孔板中的樣品，本試劑盒共可以檢測(cè)100個(gè)樣品；對(duì)于12孔中的樣品，本試劑盒共可以檢測(cè)200個(gè)樣品。
線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1法)操作步驟
1，配制JC-1染色工作液
a、六孔板每孔所需JC-1染色工作液的量為1mL，其他培養(yǎng)器皿的JC-1染色工作液的用量以此類推；對(duì)于細(xì)胞懸液每50～100萬(wàn)細(xì)胞需0.5mLJC-1染色工作液。
b、取適量JC-1（200×），按照每50µLJC-1（200×）加入8mL超純水的比例稀釋JC-1。劇烈震蕩充分溶解并混勻JC-1。然后再加入2mLJC-1染色緩沖液（5×），混勻后即為JC-1染色工作液。
2，陽(yáng)性對(duì)照的設(shè)置
把試劑盒中提供的CCCP（10mM）推薦按照11000∶的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中， 稀釋至10µM，處理細(xì)胞20分鐘。隨后按照下述方法裝載JC-1，進(jìn)行線粒體膜電位的檢測(cè)。
3，對(duì)于懸浮細(xì)胞
a、取10～60萬(wàn)細(xì)胞，重懸于0.5mL細(xì)胞培養(yǎng)液中，細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含血清和酚紅。
b、加入0.5mLJC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20分鐘。
c、在孵育期間，按照每1mLJC-1染色緩沖液（5×）加入4mL蒸餾水的比例，配制適量的JC-1染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。
d、37℃孵育結(jié)束后，600g4℃離心3～4分鐘，沉淀細(xì)胞。棄上清，注意盡量不要吸除細(xì)胞。 （5）用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2次：加入1mLJC-1染色緩沖液（1×）重懸細(xì)胞，600g4℃離心3～4分鐘，沉淀細(xì)胞，棄上清。再加入1mLJC-1染色緩沖液（1×）重懸細(xì)胞，600g4℃離心3～4分鐘，沉淀細(xì)胞，棄上清。
e、再用適量JC-1染色緩沖液（1×）重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)或流式細(xì)胞儀分析。
4，對(duì)于貼壁細(xì)胞
注意：對(duì)于貼壁細(xì)胞，如果希望采用熒光分光光度計(jì)或流式細(xì)胞儀檢測(cè)，應(yīng)先收集細(xì)胞，重懸后參考懸浮細(xì)胞的檢測(cè)方法。
a、吸除6孔板培養(yǎng)液，根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)如有必要可以用PBS或其它適當(dāng)溶液洗滌細(xì)胞一次，加入1ml細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。
b、加入1ml JC-1染色工作液，充分混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育。
c、在孵育期間，按照每1ml JC-1 Buffer(5×)加入蒸餾水的比例，配制適量的JC-1 Buffer(1×)，并放置于冰浴。
d、37℃孵育結(jié)束后， 吸除上清，用JC-1 Buffer(1×)洗滌2次。
e、加入2ml細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。
f、熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。
5，對(duì)于純化的線粒體
a、把配制好的JC-1染色工作液再用JC-1 Buffer(1×)稀釋5倍。
b、0.9ml 5倍稀釋的JC-1染色工作液中加入0.1ml總蛋白量為10～100μg純化的線粒體。
c、用熒光分光光度計(jì)或熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)：混勻后直接用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行時(shí)間掃描，激發(fā)波長(zhǎng)為485nm，發(fā)射波長(zhǎng)為590nm。如果使用熒光酶標(biāo)儀，激發(fā)波長(zhǎng)不能設(shè)置為485nm時(shí)，可以在475～520nm范圍內(nèi)設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)。
d、用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下面的步驟6。
6，熒光觀測(cè)和結(jié)果分析
檢測(cè)JC-1單體時(shí)可以把激發(fā)光設(shè)置為490nm，發(fā)射光設(shè)置為530nm；檢測(cè)JC-1聚合物時(shí)，可以把激發(fā)光設(shè)置為525nm，發(fā)射光設(shè)置為590nm。
注意：此處測(cè)定熒光時(shí)不必把激發(fā)光和發(fā)射光設(shè)置在zui大激發(fā)波長(zhǎng)和zui大發(fā)射波長(zhǎng)。如使用熒光顯微鏡觀察，檢測(cè)JC-1單體時(shí)可以參考觀察其它綠色熒光時(shí)的設(shè)置，如觀察GFP或FITC時(shí)的設(shè)置；檢測(cè)JC-1聚合物時(shí)可以參考觀察其它紅色熒光，如碘化丙啶或Cy3時(shí)的設(shè)置。
出現(xiàn)綠色熒光說(shuō)明線粒體膜電位下降，并且該細(xì)胞很可能處于細(xì)胞凋亡早期。出現(xiàn)紅色熒光說(shuō)明線粒體膜電位比較正常，細(xì)胞的狀態(tài)也比較正常。
線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1法)注意事項(xiàng)
1，JC-1（200×）在4℃、冰浴等較低溫度情況下會(huì)凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可以20-25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。
2，請(qǐng)勿把JC-1染色緩沖液（5×）全部配制成JC-1染色緩沖液（1×），本試劑盒使用過(guò)程中需直接使用JC-1染色緩沖液（5×）。
3，如JC-1 Buffer(5×)中有沉淀，必須全部溶解后才能使用，為促進(jìn)溶解可以在37℃加熱。 JC-1探針裝載完并洗滌后盡量在30分鐘內(nèi)完成后續(xù)檢測(cè)。在檢測(cè)前需冰浴保存。
4，應(yīng)避免反復(fù)凍融。不可先配制JC-1 Buffer(1×)再加入JC-1 Stain(200×)，否則導(dǎo)致JC-1很難充分溶解，嚴(yán)重影響后續(xù)的檢測(cè)?？梢?0～25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用.
5，裝載完JC-1后用JC-1 Buffer(1×)洗滌時(shí)，盡量使JC-1 Buffer(1×)保持4℃左右，此時(shí)的洗滌效果較好。
6，CCCP為線粒體電子傳遞鏈抑制劑，有毒，請(qǐng)注意小心防護(hù)。
7，為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
標(biāo)簽：線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1法)
