（1） 原理
與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯/酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針"是抗體，“顯色"用標(biāo)記的二抗。
經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。
以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。
（2） 分類
western顯色的方法主要有以下幾種：
i.放射自顯影
ii.底物化學(xué)發(fā)光ECL
iii.底物熒光ECF
iv.底物DAB呈色
現(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實(shí)驗(yàn)條件的是用第一種方法，目前發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECL。只要買現(xiàn)成的試劑盒就行，操作也比較簡(jiǎn)單，原理如下（二抗用HRP標(biāo)記）：反應(yīng)底物為過(guò)氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發(fā)光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。
（3） 主要試劑
1、丙烯/酰胺和N，N’-亞甲雙丙烯/酰胺，應(yīng)以溫?zé)?以利于溶解雙丙稀/酰胺)的去離子水配制含有29%(w/v)丙稀/酰胺和1%(w/v)N，N’-亞甲雙丙烯/酰胺儲(chǔ)存液丙稀/酰胺29g，N，N-亞甲叉雙丙稀/酰胺1g，加H2O至100ml。)儲(chǔ)于棕色瓶，4℃避光保存。嚴(yán)格核實(shí)PH不得超過(guò)7.0，因可以發(fā)生脫氨基反應(yīng)是光催化或堿催化的。使用期不得超過(guò)兩個(gè)月，隔幾個(gè)月須重新配制。如有沉淀，可以過(guò)濾。
2、十二烷基*SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去離子水配制，室溫保存。
3、分離膠緩沖液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀釋到100ml終體積。過(guò)濾后40C保存。
4、濃縮膠緩沖液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用約48ml 1mol/L HCL調(diào)至pH6.8加水稀釋到100ml終體積。過(guò)濾后40C保存。這兩種緩沖液必須使用Tris堿制備，再用HCL調(diào)節(jié)PH值，而不用Tris.CL。
5、TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙2胺催化過(guò)硫/酸銨形成自由基而加速兩種丙稀/酰胺的聚合。PH太低時(shí)，聚合反應(yīng)受到抑制。10%(w/v)過(guò)硫酸胺溶液。提供兩種丙稀/酰胺聚合所必須的自由基。去離子水配制數(shù)ml，臨用前配制.
6、SDS-PAGE加樣緩沖液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巰基乙醇3.2ml，0.05%溴酚藍(lán)1.6ml，H2O 32ml混勻備用。按1:1或1:2比例與蛋白質(zhì)樣品混合，在沸水終煮3min混勻后再上樣，一般為20-25ul，總蛋白量100μg。
7、Tris-甘/氨酸電泳緩沖液:30.3gTris，188g甘/氨酸，10gSDS，用蒸餾水溶解至1000ml，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘/氨酸電極緩沖液。臨用前稀釋10倍。
8、轉(zhuǎn)移緩沖液：配制1L轉(zhuǎn)移緩沖液，需稱取2.9g甘/氨酸、5.8gTris堿、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至總量1L。
9、麗春紅染液儲(chǔ)存液：麗春紅S 2g 三氯yi酸30g 磺基水楊酸 30g 加水至100ml 用時(shí)上述儲(chǔ)存液稀釋10倍即成麗春紅S使用液。使用后應(yīng)予以廢棄。
10、脫脂奶粉5%(w/v)。
11、NaN3 0.02% 疊氮鈉(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。
12、Tris緩沖鹽溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。
13、Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。
14、過(guò)氧化物酶標(biāo)記的第二抗體。
15、NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。
16、BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。
17、100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。
18、100mmol/L NaCl。
19、50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/L EDTA。
