【組織培養(yǎng)試劑】

一般提示：優(yōu)化您的細(xì)胞生長(zhǎng)條件。只使用新鮮配制的培養(yǎng)基和添加劑，并經(jīng)可能減少所用試劑的變更。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基—目前所使用的各種市售培養(yǎng)基(如，RPMI 1640和DMEM   )。培養(yǎng)基的成分包括營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(氨基酸，葡萄糖)，維生素，無(wú)機(jī)鹽，和緩沖物質(zhì)。有些成分非常不穩(wěn)定，因此如果不在使用時(shí)新鮮加入就可能會(huì)產(chǎn)生問(wèn)題。務(wù)必要使培養(yǎng)基避光保存。因?yàn)橐阎幸恍┙M分和緩沖物質(zhì)，如HEPES，當(dāng)暴露于光照下就會(huì)分解產(chǎn)生細(xì)胞毒性物質(zhì)。

酚紅試劑可保護(hù)細(xì)胞免受一些HEPES降解所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)，但在使用未加酚紅試劑的培養(yǎng)基的應(yīng)用場(chǎng)合下，如熒光素酶的測(cè)定，細(xì)胞毒性則仍然是一個(gè)問(wèn)題。

胎牛血清—血清是一種含有白蛋白、球蛋白、生長(zhǎng)促進(jìn)因子和生長(zhǎng)抑制因子的極為復(fù)雜的混和物。采集血清所用動(dòng)物的年齡、營(yíng)養(yǎng)水平、和健康狀況可影響到血清中這些成分的數(shù)量和質(zhì)量。因此血清易受顯著生物學(xué)變異的影響。

添加劑—某些細(xì)胞的生長(zhǎng)依賴(lài)于一些對(duì)生命力或細(xì)胞分裂  必/不可少的物質(zhì)(如，生長(zhǎng)因子，微量元素，必需代謝物和蛋白等)。

CO2培養(yǎng)箱—細(xì)胞生長(zhǎng)所需環(huán)境為37℃、相對(duì)濕度為95%的CO2培養(yǎng)箱。用CO2是為了控制pH值。細(xì)胞生理對(duì)pH的變化非常敏感，因此多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)基都含有碳酸氫鹽緩沖體系。有些培養(yǎng)基需要CO2 濃度為5%來(lái)有效控制pH值，而另一些則需要10%的CO2。需要向您的培養(yǎng)基供應(yīng)者核對(duì)一下適當(dāng)?shù)腃O2濃度。如果培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)條件與所需條件不一致(溫度、濕度和CO2)則會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的板間變異性。來(lái)自于培養(yǎng)箱內(nèi)的污染物、化學(xué)物質(zhì)，或真菌/細(xì)胞的污染也都可能影響到細(xì)胞生理

【細(xì)胞】

一般提示：密切觀(guān)察您的細(xì)胞;確保它們狀態(tài)良好。在開(kāi)始轉(zhuǎn)染細(xì)胞之前，先制定一個(gè)適當(dāng)?shù)姆N板方案，使細(xì)胞密度從轉(zhuǎn)染開(kāi)始到結(jié)束都保持最佳狀態(tài)。

增加成功幾率—細(xì)胞是轉(zhuǎn)染過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵元素，它可以是影響結(jié)果的一致性和質(zhì)量的最重要的變量。為幫助解決這些問(wèn)題，羅氏應(yīng)用科學(xué)部與ATCC?(美國(guó)菌種保藏中心)進(jìn)行了合作。

為保證將被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的質(zhì)量，羅氏應(yīng)用科學(xué)部建議使用新近從ATCC?獲得的細(xì)胞系。

分裂細(xì)胞相比較非分裂細(xì)胞—分裂細(xì)胞往往要比靜止細(xì)胞更易于攝取并表達(dá)外源DNA。因此對(duì)大多數(shù)轉(zhuǎn)染操作而言，細(xì)胞都在轉(zhuǎn)染當(dāng)天或前一天種板。同樣重要的是細(xì)胞在種板進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)不應(yīng)處于生長(zhǎng)過(guò)度的狀態(tài)。由于FuGENE? 6和HD轉(zhuǎn)染試劑對(duì)于細(xì)胞作用溫和，可同時(shí)進(jìn)行貼壁細(xì)胞的種板和轉(zhuǎn)染。

此外，還常用促有絲分裂刺激物(如，病毒轉(zhuǎn)化，生長(zhǎng)因子，條件培養(yǎng)基，以及滋養(yǎng)細(xì)胞)來(lái)活化原代培養(yǎng)細(xì)胞。

貼壁細(xì)胞相比較懸浮細(xì)胞—在轉(zhuǎn)染效率方面貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞之間的差異顯著。天生趨于懸浮的細(xì)胞(如HL 60，Jurkat)非常難以轉(zhuǎn)染。相反，天生為貼壁的細(xì)胞(如HEK，CHO)則可適應(yīng)懸浮生長(zhǎng)的條件。

這兩種細(xì)胞(即那些天然懸浮的和那些適應(yīng)懸浮的細(xì)胞)的漿膜是不一樣的。據(jù)推測(cè)轉(zhuǎn)染過(guò)程中的一個(gè)限制步驟就是通過(guò)內(nèi)吞作用攝取轉(zhuǎn)染分子(DNA或RNA與轉(zhuǎn)染試劑的復(fù)合物);然而，目前對(duì)此尚未有分子水平上的合理機(jī)制的解釋。

細(xì)胞間膜結(jié)構(gòu)的差異可能是某些細(xì)胞類(lèi)型天生難以轉(zhuǎn)染的部分原因。所以，尋找更有效轉(zhuǎn)染試劑的工作目前還主要是經(jīng)驗(yàn)性的，尤其對(duì)于那些天生為懸浮的細(xì)胞而言更是如此。

這常常是在不含血清而含有抑制轉(zhuǎn)染的特殊添加劑的培養(yǎng)基中發(fā)生。經(jīng)小心處理后，這些細(xì)胞可適應(yīng)于在沒(méi)有添加劑的環(huán)境中懸浮生長(zhǎng)。如果這些適應(yīng)于懸浮生長(zhǎng)的貼壁細(xì)胞在沒(méi)有這些添加劑的環(huán)境中生長(zhǎng)，那么它們就可以被轉(zhuǎn)染。

分批方案—在對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行分批傳代培養(yǎng)之前，必須把貼壁細(xì)胞用胰蛋/白酶消化使之脫離培養(yǎng)基質(zhì)。這個(gè)常規(guī)操作可導(dǎo)致正常細(xì)胞功能受到嚴(yán)重?fù)p害。因此分批方案的不同(如，胰蛋/白酶消化時(shí)間的延長(zhǎng)，胰蛋/白酶的失活，以及消化后直到轉(zhuǎn)染開(kāi)始的時(shí)間)都可能對(duì)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)有所影響。

如果在轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞過(guò)于密集，那么種到培養(yǎng)板上的就會(huì)是細(xì)胞團(tuán)塊而非單個(gè)細(xì)胞。

對(duì)于某些細(xì)胞/試劑組合而言，漿膜狀態(tài)被改變后有可能會(huì)影響到所用試劑和DNA的最佳配用量和配比。

傳代次數(shù)—傳代次數(shù)是指對(duì)一個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行分批傳代的頻度(通常在一個(gè)實(shí)驗(yàn)室范圍內(nèi))。在某些情況下，自建立細(xì)胞系起的確切傳代次數(shù)無(wú)法得知。

某些細(xì)胞系相比較其他細(xì)胞系而言較不穩(wěn)定，可能會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而改變，視不同的細(xì)胞系和培養(yǎng)條件而定。培養(yǎng)條件的不同可引起克隆選擇。因此名稱(chēng)相同的同一細(xì)胞系有關(guān)其生理學(xué)和形態(tài)學(xué)(以及轉(zhuǎn)染能力)性質(zhì)可能會(huì)有很大的差異。

一般而言，細(xì)胞在凍存復(fù)蘇后的一兩代之內(nèi)或直到它們*復(fù)蘇之前都很難轉(zhuǎn)染。在不同細(xì)胞系之間轉(zhuǎn)染效率的變化很大。某些細(xì)胞系在傳代很大次后仍能保持穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染效率，而其他一些則傳代很少次數(shù)就表現(xiàn)出轉(zhuǎn)染效率的差異。

細(xì)胞數(shù)量(匯聚度)—只要培養(yǎng)基質(zhì)(組織培養(yǎng)皿)尚有空間，細(xì)胞就會(huì)按指數(shù)規(guī)律分裂。對(duì)于正常細(xì)胞而言，細(xì)胞生長(zhǎng)的速度受細(xì)胞密度大小的抑制(接觸抑制)，但癌細(xì)胞則不受此限制而會(huì)繼續(xù)生長(zhǎng)并可互相疊加。

營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的耗竭以及代謝廢物的積聚會(huì)影響所有的細(xì)胞生長(zhǎng)。細(xì)胞會(huì)因受到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏的壓力而不適于轉(zhuǎn)染。

報(bào)告基因的表達(dá)率與轉(zhuǎn)染開(kāi)始時(shí)的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞健康以及它們隨后直到細(xì)胞溶解之前的生長(zhǎng)情況相關(guān)。

培養(yǎng)物污染—培養(yǎng)物可被細(xì)菌、酵母、真菌、病毒、支原體、甚至其他細(xì)胞種類(lèi)所污染。各種污染都會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)果。

支原體污染—支原體污染在所有培養(yǎng)細(xì)胞中的比例為5-35%，它可改變細(xì)胞生長(zhǎng)特性，酶的作用途徑，細(xì)胞膜的組成，染色體結(jié)構(gòu)，以及轉(zhuǎn)染效率。特別是，支原體對(duì)采用脂質(zhì)、DEAE-右旋糖酐、磷酸鈣或腺病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)有所干擾，其結(jié)果致使轉(zhuǎn)染效率偏低或非典型。這些效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不可靠以及時(shí)間和珍貴細(xì)胞系的損失。

和細(xì)菌及真菌不同，支原體污染無(wú)法通過(guò)視覺(jué)檢查發(fā)現(xiàn)。它們非常小甚至能夠通過(guò)大多數(shù)的無(wú)菌濾膜;它們還對(duì)常用抗生素有抗藥性。所以必需進(jìn)行支原體污染的常規(guī)篩查。

羅氏應(yīng)用科學(xué)部提供支原體檢測(cè)試劑盒以幫助盡早發(fā)現(xiàn)支原體污染。

交叉污染—如果同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)培養(yǎng)不同種類(lèi)的細(xì)胞，那就有可能發(fā)生交叉污染，即使遵循最/嚴(yán)格的分離操作規(guī)程這種情況也有可能發(fā)生。眾所/周知有許多細(xì)胞系被HeLa細(xì)胞所污染。和其他細(xì)胞系之間的交叉污染不總是能通過(guò)鏡檢發(fā)現(xiàn)。如果有少量某種生長(zhǎng)快速的細(xì)胞摻入到培養(yǎng)細(xì)胞種，幾個(gè)月過(guò)后它們就會(huì)*取代目標(biāo)培養(yǎng)物。這種變化是逐漸發(fā)生的;而您可能甚至還未發(fā)現(xiàn)。

建立細(xì)胞系鑒定的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。例如，對(duì)于人類(lèi)細(xì)胞系而言，STR(短串聯(lián)重復(fù)序列)圖譜就是一種可靠的鑒定方法?；蛘吒?jiǎn)單的解決方案就是，當(dāng)懷疑有交叉污染時(shí)，如果有可能，就換用新鮮的，傳代次數(shù)少的細(xì)胞源。

【載體DNA】

一般提示：對(duì)您純化所得的載體進(jìn)行質(zhì)量檢查。確定支持其正常功能的基因序列是否適合于您的細(xì)胞體系。在對(duì)您細(xì)胞體系的參數(shù)進(jìn)行測(cè)定時(shí)，一定要選用一種您已知具有功能的對(duì)照載體。

載體的完整性—種載體是否具有功能取決于它結(jié)構(gòu)的完整性。轉(zhuǎn)染效率受到質(zhì)粒制備物的超螺旋結(jié)構(gòu)和舒展結(jié)構(gòu)之間比例、雙螺旋中斷、核酸酶的降解，以及來(lái)自于儲(chǔ)存和處理過(guò)程中的物理壓力的影響。

載體制備物-各種載體是按照不同的方案在細(xì)菌體系中制備并純化。制備產(chǎn)物中殘余的污染物(如CsCl，內(nèi)毒素)可能會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。

載體構(gòu)造(啟動(dòng)子/增強(qiáng)子/ORI)—轉(zhuǎn)染體系通常用帶有強(qiáng)病毒調(diào)節(jié)元件(如，RSV，CMV，和 SV40)的對(duì)照載體進(jìn)行優(yōu)化和比較。然而，病毒啟動(dòng)子/增強(qiáng)子體系的相對(duì)有效性在不同細(xì)胞系間的差異可大到兩個(gè)數(shù)量級(jí)。例如，在某些細(xì)胞系中，由于自發(fā)的質(zhì)粒擴(kuò)增，SV40體系可高效表達(dá) large T抗原(如，COS);而在其他許多細(xì)胞系中，則是CMV啟動(dòng)子更為有效。

除此之外，各種CMV載體的表達(dá)率也會(huì)有超過(guò)一個(gè)數(shù)量級(jí)的差異，這部分是由于載體中其他調(diào)節(jié)元件所引起的。

【轉(zhuǎn)染方案】

一般提示：建立一套適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染方案;首先從一種標(biāo)準(zhǔn)方案開(kāi)始，然后通過(guò)改變?cè)噭?DNA的配比和形成復(fù)合物的數(shù)量進(jìn)行優(yōu)化。

轉(zhuǎn)染復(fù)合物的制備—諸如轉(zhuǎn)染試劑/DNA配比，離子強(qiáng)度，緩沖液pH值，以及溫度等變量都會(huì)影響到轉(zhuǎn)染復(fù)合物的組成和功能。質(zhì)粒既可在無(wú)菌水又可在TE緩沖液中稀釋。如果您要使用一種市售的轉(zhuǎn)染試劑，就應(yīng)當(dāng)仔細(xì)閱讀該試劑所提供的使用說(shuō)明。需要對(duì)試劑提供方給予一定的信賴(lài);除非您有很好的理由支持您做出改變，否則就應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格按照他們所推薦的轉(zhuǎn)染方案。在不含血清或其他蛋白的培養(yǎng)基中制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物;如果制備復(fù)合物所使用的培養(yǎng)基含有血清，它就會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生抑制。

制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物的最佳孵育時(shí)間是一個(gè)非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，對(duì)于不同的轉(zhuǎn)染試劑而言可能差別很大。

轉(zhuǎn)染試劑/DNA配比(負(fù)載比)—所有的轉(zhuǎn)染試劑都會(huì)在某一個(gè)試劑/DNA配比時(shí)最為有效。有時(shí)候這種最佳配比的所在范圍非常狹窄;而且對(duì)于每種實(shí)驗(yàn)體系都必須進(jìn)行優(yōu)化才能得到最佳配比。為了尋找這種最佳配比往往會(huì)花費(fèi)大量的時(shí)間和金錢(qián)。

除了配比的重要性之外，所加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物量的多少也非常關(guān)鍵。

形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物所用的稀釋劑—對(duì)于多數(shù)試劑而言，很關(guān)鍵的一點(diǎn)是要使轉(zhuǎn)染復(fù)合物能在普通基礎(chǔ)培養(yǎng)基和鹽溶液中形成。

FuGENE? HD 轉(zhuǎn)染試劑則是一個(gè)例外，因?yàn)樗茉谒?、不?huì)血清的培養(yǎng)基中或含有10%血清的培養(yǎng)基中生成復(fù)合物。如果您使用的是水或含有10%血清的培養(yǎng)基，則應(yīng)保證它能適用于你特定的細(xì)胞體系。

復(fù)合物數(shù)量—對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞所用的轉(zhuǎn)染試劑/DNA復(fù)合物的量也應(yīng)當(dāng)進(jìn)行優(yōu)化。如果用量太少，那么轉(zhuǎn)染DNA的表達(dá)就太弱;如果用量太多，則可能由于細(xì)胞毒性或其他作用反而降低蛋白的表達(dá)。最佳用量通常都必須進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。

這種影響用FuGENE? HD 轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)尤其明顯。

而用FuGENE? 6轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)則是一個(gè)例外，因?yàn)樗谝粋€(gè)很寬的轉(zhuǎn)染復(fù)合物用量范圍內(nèi)都會(huì)得到很好的轉(zhuǎn)染結(jié)果。在很多情況下，F(xiàn)uGENE? 6 轉(zhuǎn)染試劑的這種特性使得不再需要對(duì)轉(zhuǎn)染劑量進(jìn)行優(yōu)化過(guò)程。

所需要的轉(zhuǎn)染復(fù)合物用量與所用細(xì)胞的數(shù)量相關(guān)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞越少，所需復(fù)合物就越少。

轉(zhuǎn)染復(fù)合物的加入—有兩種替換方法可用來(lái)漿轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入轉(zhuǎn)染細(xì)胞：1. 將復(fù)合物濃縮液逐滴加入培養(yǎng)基，或者2. 將轉(zhuǎn)染復(fù)合物先用培養(yǎng)基稀釋?zhuān)缓筮M(jìn)行培養(yǎng)基更換操作。第一種方法更簡(jiǎn)便，而第二種方法則更因?yàn)楸苊饬嗽噭┰诰植繚饩鄱a(chǎn)生毒性，所以會(huì)使結(jié)果的一致性更好。

對(duì)于諸如FuGENE? 6 轉(zhuǎn)染試劑和HD轉(zhuǎn)染試劑這類(lèi)的溫和試劑而言，您可以先將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入培養(yǎng)容器，然后再加入用胰蛋/白酶新鮮消化得到的細(xì)胞。

轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基—轉(zhuǎn)染過(guò)程中所使用的培養(yǎng)基對(duì)轉(zhuǎn)染效率可能會(huì)有正面或負(fù)面的影響。甚至對(duì)于基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方而言也是如此，尤其是在培養(yǎng)基中加入牛血清的情況下。胎牛血清的存在會(huì)使多種轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率降低. 某些公司還提供可與轉(zhuǎn)染試劑配合使用的優(yōu)化無(wú)血清轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基。而由羅氏應(yīng)用科學(xué)部所提供的轉(zhuǎn)染試劑則無(wú)論是否存在血清都能有效轉(zhuǎn)染。

FuGENE? H D是獨(dú)1無(wú)二的能夠轉(zhuǎn)染保存在100%血清中腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染試劑。

如果有抗生素(如，青/霉素、鏈/霉素、或兩性/霉素B)存在的情況下培養(yǎng)細(xì)胞，則轉(zhuǎn)染有效性會(huì)降低至25%。因此，對(duì)于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，我們建議使用不加抗生素的培養(yǎng)基。

【時(shí)間進(jìn)度】

一般提示：要確保最終結(jié)果的成功;建立一個(gè)合適的時(shí)間進(jìn)度進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)以保證您所需要的目標(biāo)蛋白能得到最佳表達(dá)。

轉(zhuǎn)染的開(kāi)始—在轉(zhuǎn)染前12小時(shí)，將細(xì)胞分種于培養(yǎng)板中。在轉(zhuǎn)染開(kāi)始時(shí)，培養(yǎng)物應(yīng)當(dāng)有約50-80%匯聚，這樣就可以使它們?cè)趯?shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)達(dá)到接近100%的匯聚。

如果在轉(zhuǎn)染中去掉血清，細(xì)胞可能會(huì)暫時(shí)停止生長(zhǎng)。

細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)染復(fù)合物的攝取通常在0.5-6小時(shí)的時(shí)間內(nèi)完成。在這段時(shí)間后，就不會(huì)再發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率有所增長(zhǎng)。

培養(yǎng)基更換—某些轉(zhuǎn)染試劑在攝取階段之后需要更換培養(yǎng)基。如果轉(zhuǎn)染必須在沒(méi)有胎牛血清存在的條件下進(jìn)行，那么這一步驟就必不/可少。至于可在血清存在的情況下使用的無(wú)毒性轉(zhuǎn)染試劑(如，F(xiàn)uGENE? 6 轉(zhuǎn)染試劑或FuGENE? HD 轉(zhuǎn)染試劑)時(shí)，如果有足夠的培養(yǎng)基用于后續(xù)表達(dá)階段，就可以省略這一步。

如果將轉(zhuǎn)染復(fù)合物留在細(xì)胞中直到進(jìn)行檢測(cè)，那么對(duì)有些細(xì)胞系而言轉(zhuǎn)染效率會(huì)有所提高，而另外一些細(xì)胞在轉(zhuǎn)染開(kāi)始幾個(gè)小時(shí)之后其轉(zhuǎn)染效率就不會(huì)再有升高。

雖然在轉(zhuǎn)染步驟之后轉(zhuǎn)染試劑/DNA復(fù)合物通常不一定要從培養(yǎng)體系中清除，但在此后的長(zhǎng)期生長(zhǎng)階段換用新鮮的培養(yǎng)基卻是必須的。如果轉(zhuǎn)染細(xì)胞需要生長(zhǎng)3-7天，換培養(yǎng)基就尤其重要，這樣一來(lái)就使它們有時(shí)間達(dá)到最高的蛋白表達(dá)量。

時(shí)間測(cè)定—通常在轉(zhuǎn)染開(kāi)始后的24-48小時(shí)間分析報(bào)告基因的表達(dá)。在這一時(shí)間段內(nèi)，報(bào)告基因產(chǎn)物的濃度逐漸增加;而這種增加取決于增強(qiáng)子的強(qiáng)度、在表達(dá)外源蛋白中所涉及的細(xì)胞反應(yīng)，存活細(xì)胞的健康狀態(tài)，以及營(yíng)養(yǎng)因素等。

如果您要收集蛋白進(jìn)行純化，在轉(zhuǎn)染后等待3-7天就更為常見(jiàn)了。在收集蛋白時(shí)，培養(yǎng)基中加入COMPLETE*蛋白酶抑制劑用來(lái)防止蛋白降解是一個(gè)很好的措施。