酶切的原理：

DNA酶切一般分為質(zhì)粒直接酶切和PCR產(chǎn)物酶切。限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點上，并切割雙鏈DNA。它可分為三類:Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類。Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴于ATP的存在。Ⅰ類酶結(jié)合于識別位點并隨機的切割識別位點不遠處的DNA，而Ⅲ類酶在識別位點上切割DNA分子，然后從底物上解離。Ⅱ類由兩種酶組成: 一種為限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)，它切割某一特異的核苷酸序列; 另一種為獨立的甲基化酶，它修飾同一識別序列。Ⅱ類中的限制性內(nèi)切酶在分子克隆中得到了廣泛應(yīng)用，它們是重組DNA的基礎(chǔ)。絕大多數(shù)Ⅱ類限制酶識別長度為 4至6個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列(如EcoRⅠ識別六個核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3')，有少數(shù)酶識別更長的序列或簡并序列。Ⅱ類酶切割位點在識別序列中，有的在對稱軸處切割，產(chǎn)生平末端的DNA段(如Sma Ⅰ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位點在對稱軸一側(cè)，產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA段稱粘性未端，如EcoRⅠ切割識別序列后產(chǎn)生兩個互補的粘性末端。

5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'

3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'

DNA純度、緩沖液、溫度條件及限制性內(nèi)切酶本身都會影響限制性內(nèi)切酶的活性。大部分限制性內(nèi)切酶不受RNA或單鏈DNA的影響。當(dāng)微量的污染物進入限制性內(nèi)切酶貯存液中時，會影響其進一步使用，因此在吸取限制性內(nèi)切酶時，每次都要用新的吸管頭。如果采用兩種限制性內(nèi)切酶，必須要注意分別提供各自的最適鹽濃度。若兩者可用同一緩沖液，則可同時水解。若需要不同的鹽濃度，則低鹽濃度的限制性內(nèi)切酶必須首先使用，隨后調(diào)節(jié)鹽濃度，再用高鹽濃度的限制性內(nèi)切酶水解。也可在第一個酶切反應(yīng)完成后，用等體積酚/氯仿抽提，加0.1倍體積3mol/L NaAc和2倍體積無水乙醇，混勻后置-70℃低溫冰箱30分鐘，離心、干燥并重新溶于緩沖液后進行第二個酶切反應(yīng)。

DNA限制性內(nèi)切酶酶切圖譜又稱DNA的物理圖譜，它由一系列位置確定的多種限制性內(nèi)切酶酶切位點組成，以直線或環(huán)狀圖式表示。在DNA序列分析、基因組的功能圖譜繪制、DNA的無性繁殖、基因文庫的構(gòu)建等工作中，建立限制性內(nèi)切酶圖譜都是bu可缺少的環(huán)節(jié)，近年來發(fā)展起來的RFLP(限制性片段長度多態(tài)性)技術(shù)更是建立在它的基礎(chǔ)上。

構(gòu)建DNA限制性內(nèi)切酶圖譜有許多方法。通常結(jié)合使用多種限制性內(nèi)切酶，通過綜合分析多種酶單切及不同組合的多種酶同時切所得到的限制性片段大小來確定各種酶的酶切位點及其相對位置。酶切圖譜的使用價值依賴于它的準(zhǔn)確性和精確程度。

在酶切圖譜制作過程中，為了獲得條帶清晰的電泳圖譜，一般DNA用量約為0.5-1μg。限制性內(nèi)切酶的酶解反應(yīng)最適條件各不相同，各種酶有其相應(yīng)的酶切緩沖液和最適反應(yīng)溫度(大多數(shù)為37℃)。對質(zhì)粒DNA酶切反應(yīng)而言， 限制性內(nèi)切酶用量可按標(biāo)準(zhǔn)體系1μg DNA加1單位酶，消化1-2小時。但要wan全酶解則必須增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反應(yīng)時間也要適當(dāng)延長。

實驗材料 ：

λDNA; 重組pBS質(zhì)料或pUC19質(zhì)粒; EcoRI酶及其酶切緩沖液; HindⅢ酶及其酶切緩沖液;瓊脂糖(Agarose)。

實驗試劑：

5×TBE電泳緩沖液：

6×電泳載樣緩沖液：0.%溴粉藍，40%(w/v) 蔗糖水溶液，貯存于4℃。

溴化乙錠(EB溶液母液:將EB配制成10mg/ml，用鋁箔或黑紙包裹容器，儲于 室溫即可。

實驗步驟：

1、 DNA酶切反應(yīng)

1) 將清潔干燥并經(jīng)滅菌的eppendorf管(最好0.5ml)編號，用微量移液槍分別加入DNA 1μg和相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)10×緩沖液2μl，再加入重蒸水使總體積為19μl。

2) 將管內(nèi)溶液混勻后加入1μl酶液，用手指輕彈管壁使溶液混勻，也可用微量離心機甩一下，使溶液集中在管底。此步操作是整個實驗成敗的關(guān)鍵，要防止錯加，漏加。使用限制性內(nèi)切酶時應(yīng)盡量減少其離開冰箱的時間，以免活性降低。

3) 混勻反應(yīng)體系后，將eppendorf管置于適當(dāng)?shù)闹С治锷希ㄈ绮逶谂菽芰习迳希?7℃水浴保溫2-3小時，使酶切反應(yīng)wan全。

4) 每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，混勻，以停止反應(yīng)，置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?br/>
2、 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的制備

采用EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA段來作為電泳時的分子量標(biāo)準(zhǔn)。λDNA為長度約50kb的雙鏈DNA分子，其商品溶液濃度為 0.5mg/ml，酶解反應(yīng)操作如上述。HindIII切割 DNA后得到8個片段，長度分別為23.1， 9.4， 6.6， 4.4， 2.3， 2.0， 0.56和0.12kb。EcoRI切割lDNA后得到6個片段，長度 分別為21.2， 7.4， 5.8， 5.6， 4.9和2.5kb。

3、 瓊脂糖凝膠電泳

1) 膠板的制備（參見瓊脂糖凝膠電泳詳細說明）。

2) 加樣：取10μl酶解液與2μl 6×載樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個樣品要更換tip 頭，以防止互相污染，注意上樣時要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。

3) 電泳：加完樣后，合上電泳槽蓋，立即接通電源。控制電壓保持在60-80V，電流在40mA以上。當(dāng)溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約2cm時，停止電泳。

4) 染色：未加EB的膠板在電泳完畢后移入0.5μg/ml的EB溶液中，室溫下染色20-25分鐘。

5) 觀察和拍照：在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。紫光燈下觀察時應(yīng)戴上防護眼鏡或有機玻璃面罩，以免損傷眼睛。經(jīng)照相機鏡頭加上近攝鏡片和紅色濾光片后將相機固定于照相架上，采用全色膠片，光圈5.6，曝光時間10-120秒(根據(jù)熒光條帶的深淺選擇)。

6) DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：在放大的電泳照片上，以樣品槽為起點，用卡尺測量λDNA的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的遷移距離，以厘米為單位。以核苷酸數(shù)的常用對數(shù)為縱坐標(biāo)，以遷移距離為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出連結(jié)各點的平滑曲線，即為該電泳條件下DNA分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

7) DNA酶切片段大小的測定：在放大的電泳照片上，用卡尺量出DNA樣品各片段的遷移距離，根據(jù)此數(shù)值，在DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的對數(shù)值，進一步計算出各片段的分子量大小(若用單對數(shù)坐標(biāo)紙來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，則可根據(jù)遷移距離直接查出DNA段的大小)。反之，若已知DNA段的大小亦可由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它預(yù)計的遷移距離。