在應用MALDI-TOF MS時，通常將微生物樣本與一種飽和的低分子量無機化合物溶液（稱為基質）進行混合加在靶板上，待干后樣本與基質共結晶后形成了以基質包裹構架的樣本固體沉淀。樣本基質結晶體經激光輻射，基質從激光中吸收能量使樣品吸附，基質與樣品之間發(fā)生電荷轉移使得樣品分子電離，離子在加速電場下獲得相同的動能，經高壓加速、聚焦后進入飛行時間檢測器。

　　根據(jù)離子飛行時間的不同進行分析得出離子質荷比（m/z）和離子峰值，形成質量圖譜。不同的微生物由于蛋白分子組成有差異而形成具有特異性的圖譜，通過軟件對數(shù)據(jù)庫的比對進行微生物種或菌株的區(qū)分和鑒定。

　　質譜鑒定方法十分迅速，可以在數(shù)分鐘內完成微生物鑒定，有研究顯示MALDI-TOF MS與傳統(tǒng)方法比較降低了實驗室成本和出報告的時間，與傳統(tǒng)方法所需的數(shù)小時相比是一個質的飛躍。此外，質譜操作簡便，通量高，可以同時鑒定多個樣本。通常質譜數(shù)據(jù)庫是作為儀器的組成部分，由各自公司開發(fā)和維護，這一點有別于公共開放數(shù)據(jù)庫。

　　質譜儀數(shù)據(jù)庫的可擴展性對于進一步的鑒定分析非常重要，尤其是菌種間的區(qū)分和流行病學研究等。由于不同的平臺都是在各自的系統(tǒng)中建立自身的數(shù)據(jù)庫并且發(fā)展自身的軟件、算法和評分標準，因此不同的質譜系統(tǒng)給出的數(shù)字信息不具備可比性。不同的質譜系統(tǒng)的比較要通過對微生物鑒定最終結果的準確程度來實現(xiàn)。